O HIV desenvolve rapidamente a resistência à “técnica de cura da edição de genes”

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A resistência pode ser o calcanhar de Aquiles da abordagem de engenharia genética

Desenvolve resistência à terapia em até 8 dias

Uma das “técnicas literalmente conduz o vírus à resistência conta ela mesma

Em um revés para uma abordagem inovadora para a cura do HIV, pesquisadores envolvidos em uma técnica que utiliza enzimas para remover genes virais a partir do DNA de células infectadas descobriram que o HIV se adapta facilmente a esta ação e desenvolve rapidamente resistência ao guia que leva as moléculas ao alvo que carregam a parte correta de uma sequência de DNA celular Humano. Os vírus resistentes podem, ainda, desenvolver uma cepa mais agressiva do vírus e replicar-se ainda mais rapidamente do que os vírus não expostos à terapia gênica (embora ainda sejam suscetíveis às drogas antirretrovirais convencionais (ARV)).

Além disso, os pesquisadores sugerem a forma como funciona a terapia gênica pode, realmente, promover o desenvolvimento de resistência, pois trabalha ativamente na criação de pequenas mutações no local onde é cortado o DNA celular. A resistência emerge rapidamente – no prazo de 8 dias a contar da primeira aplicação da terapia se tornar ativa.

Isso não significa que todo a abordagem de edição de genes está condenada ao fracasso, mas isso implica que o gene da enzima degradante que necessita de ser anexado a uma grande variedade de diferentes “genes sondas”, projetados para fixarem um número maior de diferentes pontos do DNA viral oculto dentro do DNA humano nas células infectadas.

A tecnologia genética envolve o transporte de uma enzima-DNA denominada CRISPR degradantes ou cas9 no coração do núcleo de células humanas. A enzima cas9 que foi originalmente encontrada dentro de bactérias como uma defesa natural contra o vírus, é anexada a um único comprimento da vertente “guia ” (sgRNA RNA) que orienta a cas9 para a parte específica de DNA infiltrado pelo HIV em seu processo de integração do RNA recém convertido em DNA que precisa ser removido para eliminar o “controle” do HIV sobre a célula terminando, assim, naquela célula, o ciclo de vida do HIV.

O conceito não é muito diferente da versátil terapia gênica chamada de interferência curta sobre o RNA (siRNA), que está sendo investigado para a um número de doenças incluindo hepatite B crônica (este link leva a um texto em outro site, em inglês, que também será traduzido). Mas considerando que metas de siRNA e degradação do “RNA mensageiro” e as moléculas do órgão que atuam como máquinas de replicação de vírus dentro da parte principal do citoplasma da célula (), sgRNA/cas9 meta DNA Integrado, o modelo de ‘Master’ para fabricação dos retrovírus como o HIV insere em um núcleo das células as instruções genéticas que existem no núcleo celular e não no citoplasma circundante.

Este estudo

Neste estudo in vitro os pesquisadores de células T infectadas com três diferentes “genes sondas” sgRNA/cas9 projetados para diferentes seções do DNA do HIV integrado ao núcleo celular.

Um, denominado T4, é anexado à área gag/pol do genoma do HIV, que inclui espaço a função do HIV equivalente a uma “máquina copiadora de DNA“; um segundo gene, o T10, é anexado ao env/rev, que inclui as instruções para formar o “envelope viral”. Nestes dois casos a própria sgRNA conectada a um único ponto específico do DNA viral é clivada em duas partes, permitindo ao cas9 degradar as pontas desfiadas do ainda DNA Viral.

Um mecanismo de reparo molecular intracelular chamado NHEJ (remontadoras não homólogas finais) reparam, eventualmente, as pontas desfiadas do DNA, mas este é mais propenso a “erros” de cópia e introduzem alterações na cadeia do DNA, algumas das quais podem conferir resistência do HIV.

O terceiro gene sonda, chamado LTR-B, era semelhante ao utilizado em um estudo informamos sobre no final de março (Também abre em outro site, em inglês e nós tentaremos traduzir em tempo oportuno). Isso corta o DNA nos dois pontos que estão localizados na ou próximo da sequência chamada Litros (Repetição Terminal de Longa Duração em tradução livre e interpretativa – aceito sugestões coerentes) que representam os pontos da extremidade do material genético do HIV. Assim realiza uma remoção completa de todos os materiais componentes do HIV da célula infectada.

Uma das implicações do LTR-B é, como sempre, a resistência se a célula permanecer capaz de produzir HIV, o que, em tese ela poderia ser capaz, por haver algumas partes restantes do DNA que, embora defeituoso, ainda seja capaz de produzir vírus infecciosos. Deve ser porque o DNA do HIV possa ter sofrido uma mutação para uma forma que é resistente a “apreensão” pelo sgRNA em primeiro lugar.

Resultados e implicações

Produção de partículas virais foi comparada entre células tratadas com sgRNA/cas9 e células tratadas com cas9 sozinho. Os pesquisadores descobriram que, como esperado, reprodução viral foi inicialmente severamente prejudicada em células infectadas com o gene sonda sgRNA/cas9. Em geral, os níveis de produção viral de pico foram 83% inferior em células tratadas com T4, por 95% naqueles tratados com T10, e por cerca de 98% nas células tratadas com LTR-B.

A produção viral começou cerca de cinco dias após a infecção em células de controle, mas foi adiada por cerca de quatro dias em células tratadas com LTR-B e por cerca de dez dias em células tratadas com T4 ou T10. No entanto, havia significativa produção viral no fim do LTR em células B, níveis virais no pico de produção de PF – que também foi adiada por quatro dias –  era ainda 55% inferior em células-controle. Mas em células tratadas com T10 foi exatamente o mesmo em células de controle – embora atrasada por oito dias – e realmente foi cerca de 20% maior em células T4. Isto sugere que a resistência viral acontece rapidamente.

Em amostras de vírus, 74% de T4, 70% de T10 e 72% de LTR-B vírus tiveram seu DNA alterado da forma esperada por três sondas genéticas diferentes. Nos outros 16%, 20% e 18%, houve mutações de algum tipo e, a algumas das quais foram atribuídas a geração de resistência.

Os pesquisadores realizado o experimento novamente em células infectadas com o vírus HIV tomadas a partir do pico de produção viral no experimento anterior ao que foi esperado em todos a se tornar resistente. Os vírus resistentes tratados com o T4 novamente produziram 20% mais vírus do que as células de controle e no caso de células tratadas com T10, eles produziram a mesma quantidade de vírus como controle de células, mas realmente atingiu o pico da produção viral seis dias mais cedo. Isso sugere que o HIV que se tornara resistente a T4 ou T10 foi pelo menos como aplicar um controle de reprodução do vírus, ou um instalador.

No caso do LTR-B tratados com vírus resistentes, o pico de produção viral também foi atingido cerca de seis dias mais cedo do que o vírus de controle, mas os níveis de produção viral permaneceram 30% inferiores, sugerindo que os vírus resistentes ao LTR-B podem estar pagando o preço de uma pequena resistência para o seu reprodutor.

Em vírus resistentes ao T4 houve uma predominância de um único ponto de mutação (uma mutação genética com apenas uma “carta” o alterou). Esta representou uma cota de 81% de vírus resistentes e outra mutação de ponto único representou 13% deles. Em vírus resistentes ao T10, enquanto uma única mutação de ponto representou 38% de vírus resistentes a outros vírus resistentes tiveram, em geral, uma mutação mais complexa de 3 ou 4 pontos de alterações.

A resistência dos vírus resistentes ao LTR-B foi mais incomum. O T4 e o T10 extraíram apenas pequenas partes do genoma viral; se for reparado de forma imprecisa, isto pode criar cepas resistentes. Neste caso é a maquinaria celular NHEJ, que volta ao e DNA imprecisamente “editado”, que é o núcleo da resistência. Mas o LTR-B deve remover todo o genoma viral, de modo que a junção do DNA viral não deveria ter a chance de até mesmo começar a produzir vírus mutantes. Onde estava a resistência? Proveniente de que ou do que?

Os pesquisadores descobriram que uma pequena proporção dos vírus resistentes ao T4 e ao T10, mas todos os vírus resistentes ao LTR-B, não tinham substituições de uma base genética para outra, como a maioria dos vírus resistentes, mas tinha secções inteiras removidos ou inseridas no código genético – o chamado “indels”.

Isso sugere que foi o próprio sgRNA/cas9 que estava causando a resistência nesses casos. O cas9 desarranjando o DNA no local de clivagem de tal forma que ele estava produzindo os vírus resistentes.

Neste caso, a resistência não foi causada pela transação viral de negócios na presença de baixos níveis de droga, que exercem uma pressão evolutiva seletiva – o que estava sendo causado era gerado diretamente pela droga em si. Em suma, sgRNA/cas9 foi agindo como um agente mutagênico, um driver direto da mutação viral em direção à cepa resistente ao próprio sgRNA/cas9. Nota do editor. Em bom português isso me faz lembrar de tiro saindo pela culatra. Este tipo de “tiro”, o que sai pela culatra, mata “apenas” uma pessoa, se escapar do controle e sair para as ruas…

Algumas drogas antivirais não convencionais geram problemas e trabalho por serem mutagênicas, tais como a ribavirina, mas neste caso eles trabalham no genoma viral. siRNAs também podem apresentar mutações diretamente no RNA citoplasmático. Mas esta é a primeira vez que uma proposta de tratamento do HIV foi vista contribuindo diretamente para a produção de mutações resistentes dentro do DNA proviral no coração de células.

Enquanto a produção de resistência seria trazida para baixo para um mínimo, pelo uso de múltiplos sgRNAs, como os pesquisadores sugerem, este estudo mostra que reveses inesperados podem estar à espera dos pesquisadores sobre a forma de uma cura para o HIV e que a nova edição de gene e outras técnicas envolvidas pode representar riscos de sua própria pesquisa ou vida, a depender de como se conduz e em que tipo de estudo, in vitro ou humanos, podendo gerar graves problemas.

Nota do editor: eu fico muito feliz quando sinto que posso dar uma boa notícia a meus leitores e, quanto mais eu avanço na pesquisa e na tradução destes textos, que as vezes me fazem ir estudar “um pouco de genética para poder traduzí-los”, me tornam cada vez mais cuidadoso e ponderado com o que eu publico e eu não vi, em minhas fontes, que eu reputo sensatas, nenhuma menção sobre está cura surgida em Londres. Eu detesto parecer a Cassandra anunciando o apocalipse e tudo o que eu peço é atenção e cautela. Eu adoraria ter certeza absoluta que determinado estudo ealmente conseguiu encontrar a cura do HIV, mas eu sei que entre a aplicação desta possível cura, que deve ter um protocolo de aplicação que deve, quando pouco, determinar um tratamento de X tempo e um período de “DELTA” tempo à espera da comprovação da remissão completa, da eliminação dos reservatórios (os intestinos são uma área inacreditavelmente  grande onde o HIV pode se ocultar e se ele ficar oculto lá, para sempre, talvez isso seja aceitável como uma condição médica que conduza a pessoa a uma vida sem TARV mas com uma complexa agenda de coleta de material para exames pelo resto da vida e este, mesmo sendo uma cura, me tem a cara de uma doença, pois eu estou aqui, 02:22 da manha simplesmente porque tive um excelente dia e acreditei que a gripe suspeitíssima que me apanhou (eu tomei a vacina) tinha ido embora e, bastou que eu me deitasse para, depois de dez minutos eu ter certeza que não dormiria -0 eu não estou curado de uma gripe para a qual eu me vacinei e eu não sou, a esta altura da vida – 52 anos de idade, 22 deles com HIV, dado a abusos e, para ser honesto de verdade eu só vou à rua se for obrigado por um compromisso que não possa ser resolvido aqui mesmo.

Eu era bem seletivo na escolha de pessoas que podiam entrar em minha casa e, depois de ter sido tratado como um idiota por alunos da ESPM que me enganaram com um cinismo odioso e deplorável (tudo o que eu lhes pedi foi que não mudassem meu nome ou que ocultassem meu rosto e foi exatamente isso que eles fizeram. Moral da história: Entrevista, mesmo que para estudantes do fundamental, terão de ser remuneradas e, doa a quem doer eu vou olhar o ajuste da câmera e fazer com que os eventuais interessados em utilizar meu trabalho para suas formação profissionais estejam submetidas a um contrato com meus inegociáveis termos ou nada. Agradeçam todos aos alunos da ESPM porque foi o comportamento infantil, imoral, ladino e trapaceiro que me levou a estas ilações e isso não será mudado at´pe o dia de minha morte.

Desta forma, em nome da prudência. Estamos reunidos em torno de um problema que, falando genericamente falando, nós nos deixamos envolver por pura, requintada e tola imprudência. Quantos de nós, e até mesmo eu, não paramos, num momento em que a crise na saúde se instala, sente vontade de voltar no tempo e dar com um taco de baseball na cabeça daquele “nosso eu imprudente” e deixar um recado para ele que seria, eu creio, mais ou menos assim. Use camisinha seu/sua baba-ovo.

Estou investigando esta suposta cura na Inglaterra. Tenho boas fontes lá e nada me foi mandado. Talvez não haja nada para mandar e todo este alarde é uma espécie de “caça-cliques”. Ou, quem poderia saber (???) eu caí em desgraça com eles e terei de pesquisar deeper and deeper.

Bem, a gripe não dá sossego e minhas vias nasais estão interditadas. Quem pode dormir assim?

Vou para a Netflix, assistir Luke Cage, pois estou morto de curiosidade com o que vem a seguir.

Sim, pessoas, eu jogo duro, mas é porque a vida não me deu escolha e personagens como Daredevil, The Punisher, Luck Cage e Jessica Jones me trazem, ao menos por alguns minutos, a sensação que pode haver justiça ou, pelo menos, conforme alguém que está muito longe, na noite dos tempos, haja a justeza das contas e, se eu não posso cobrar as minhas, permitam-me delirar de alegria vendo “justiceiros” fazendo algo que eu gostaria muito de poder fazer.

Sim, menina esperta, eu trilhei uma longa estrada e, emboara eu possa lhes dar muitas verdades, meu livro os deixará a pensar em como eu pude passar por tudo aquilo que vocês lerão. Eu digo que esta foi a parte fácil. Há uma parte difícil, e eu não ouso sequer pensar em pola num documento do Word… Que se dirá se eu os pusessem em um livros… rsrsrs Até a próxima.

Cau. Está é uma maneira carinhosa que uma baiana deliciosamente amorosa escolheu para se referir a mim. Quando uma mulher me chama de Cau, meu coração bate mais forte, a respiração se confunde e tudo o que eu posso lembrar é da frase, depois de posto o preservativo:

“Agora eu posso…”

O que veio depois…. Foi o caos… (…) … Faz quase vinte anos e, algumas vezes, ainda sinto o amargor do fel que foi despejado sobre mim. E a pergunta funesta: Como é que você vai se virar quando a maré encher? Eu não respondi nada, mas pensei: nadando.

 

Gus Cairns

Publicado em: 17 de Maio de 2016

Traduzido por Claudio Souza do Original em HIV rapidly develops resistance to gene-editing cure technology por Gus Cairms para o AIDSMAP revisado por Mara Macedo

Reference

Wang Z et al. CRISPR/Cas9-derived mutations both inhibit HIV-1 replication and accelerate viral escape. Cell Reports, 15, pages 1-9. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.042. April 2016.

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